Bộ PCR thời gian thực virus Monkeypox

1. MẫuBộ sưu tập:Mẫu bệnh phẩm phải được thu thập vào các ống vô trùng theo đúng quy định

với các thông số kỹ thuật tiêu chuẩn.

2. Chuẩn bị thuốc thử (Khu vực chuẩn bị thuốc thử)

Lấy các thành phần của bộ sản phẩm ra, cân bằng ở nhiệt độ phòng để sử dụng ở chế độ chờ.

3. Xử lý mẫu vật (Khu vực xử lý mẫu vật)

3.1 Chiết xuất axit nucleic

Nên lấy 200μL mẫu chất lỏng, Kiểm soát dương tính và Kiểm soát âm tính để chiết xuất axit nucleic, theo các yêu cầu và quy trình tương ứng của bộ dụng cụ chiết DNA virus.

3.2 Hòa tan bột đông khô và bổ sung mẫu

Chuẩn bị premix đông khô Monkeypox Virus theo số lượng mẫu.Một mẫu cần một ống PCR chứa bột trộn sẵn đông khô.Đối chứng âm tính và đối chứng dương tính nên được coi là hai mẫu.

(1) Thêm 15μL Dung dịch hòa tan vào mỗi ống PCR chứa premix đông khô, sau đó thêm 5μL mẫu đã chiết/Kiểm soát âm tính/Kiểm soát dương tính vào từng ống PCR tương ứng.

(2) Đậy kín các ống PCR, lắc ống PCR bằng tay cho đến khi bột đông khô hòa tan hoàn toàn và hòa quyện, thu chất lỏng xuống đáy ống PCR bằng cách ly tâm tức thời tốc độ thấp.

(3) Nếu sử dụng thiết bị Real-time PCR thông thường để phát hiện thì chuyển trực tiếp các ống PCR đến khu vực khuếch đại;nếu sử dụng BTK-8 để phát hiện thì cần thực hiện thao tác sau: chuyển 10 µL chất lỏng từ ống PCR vào giếng chip phản ứng của BTK-8.Một ống PCR tương ứng với một giếng trên chip.Trong quá trình vận hành pipet, đảm bảo pipet thẳng đứng 90 độ.Các đầu tip pipet chắn khí dung nên được đặt vào giữa giếng với lực vừa phải và dừng đẩy pipet khi đến số một (để tránh bong bóng).Sau khi các giếng được lấp đầy, lấy màng chip phản ứng ra phủ kín tất cả các giếng và sau đó chip được chuyển đến vùng phát hiện khuếch đại.

4. Khuếch đại PCR (Vùng phát hiện)

4.1 Đặt ống PCR/chip phản ứng vào bể phản ứng và đặt tên từng giếng phản ứng theo thứ tự tương ứng.

4.2 Cài đặt phát hiện huỳnh quang: (1) Virus Monkeypox (FAM);(2) Kiểm soát nội bộ (CY5).

4.3 Chạy giao thức đạp xe sau

Giao thức của ABI7500, Bio-Rad CFX96, SLAN-96S, QuantStudio:

 Giao thức của BTK-8:

5. Phân tích kết quả (vui lòng tham khảo Hướng dẫn sử dụng thiết bị)

Sau phản ứng, kết quả sẽ được lưu tự động.Nhấp vào “Phân tích” để phân tích và thiết bị sẽ tự động diễn giải giá trị Ct của từng mẫu trong cột kết quả.Các kết quả kiểm soát âm tính và dương tính phải tuân theo "6. Kiểm soát chất lượng" sau đây.

6. Kiểm soát chất lượng

6.1 Đối chứng âm tính: Không có Ct hoặc Ct>40 trong kênh FAM, Ct<40 trong kênh CY5 với đường cong khuếch đại bình thường.

6.2 Kiểm soát dương tính: Ct<35 ở kênh FAM với đường cong khuếch đại bình thường, Ct<40 ở kênh CY5 với đường cong khuếch đại bình thường.

6.3 Kết quả là hợp lệ nếu đáp ứng tất cả các tiêu chí trên.Nếu không, kết quả không hợp lệ.

Giải thích kết quả

Có thể có các kết quả sau:

GHI CHÚ: Nếu kết quả không hợp lệ, mẫu cần được thu thập và kiểm tra lại.